•   产品定义

            BSA（Bulked segregation analysis）即混合分组分析，也称分离群体分组分析，是一种通过在群体中挑选极端或代表性性状的个体组成混池进行分析的方法。通过研究混池之间等位基因/分子标记频率的差异，将与性状相关的位点在基因组上进行定位。

            随着NGS技术的发展，BSA分析的方法和技术系统已经逐步的完善。同时依托于不断降低的测序成本，基于NGS的BSA分析已经在真核酵母、粮食作物、经济作物、畜牧业、林木、昆虫等不同物种中得到了应用。

      文库 测序量
    二代测序

    350-500bp WGS文库

                                    亲本 ≥ 20X

    子代混池 ≥ 30X

    ◎QTL-seq法

           该方法是BSA的经典方法，其通过两个性状分离的纯合亲本进行杂交，构建F2/RIL/DH等子代群体，这些子代群体中会发生性状分离，在子代群里中分别选择极端性状（如最高/最矮）的20-30个个体进行混池全基因组重测序，比对至目标性状的参考基因组后计算SNP-index，并计算Δ(SNP-index)比较两个混池之间的遗传变异基因型频率差异。

           基因组大部分区域的遗传变异因为变异遗传的随机性在两个混池中的SNP-index会表现出相似的频率分布，而与研究性状相关的区域则会在两个混池中表现出较大的差异分布，通过这种差异就可以定位到目标性状相关的基因组区域。

    测序方案

    参考基因组需求 测序个体数
    是

    4个：亲本2个；子代（20-30个个体）混池2个

                                 2个：子代（20-30个个体）混池2个

     

    图1 QTL-seq基于Δ(SNP-index)的分析方法

    ◎MutMap法

            该方法与QTL-seq相比，其首先需要使用化学诱变剂如EMS等获取突变体，在其中选择研究目标相关的表型纯合突变体与野生型的纯合亲本杂交，再在F2子代中选择突变表型的个体进行混池测序。此时只需要对野生型亲本和突变型的子代混池进行测序即可。

    图2 MutMap法

    ◎MutMap+法

            作为MupMap的plus版本，MutMap+采用基因型为杂合、表型为野生型的个体进行自交产生后代，对于早期突变致死或者是异交不亲和的突变株能够进行有效分析。

    ◎MutMap-Gap法

            前三种方法都依赖于亲本的参考序列，MutMap-Gap方法作为MutMap + De novo的结合体，避免了参考基因组上突变位点缺失的问题

    图4 MutMap-Gap法

    图3  MutMap+法

  •      通过SNP-index或Δ(SNP-index)的分布趋势，快速定位性状关联目标区域

    图1 SNP-indx及Δ(SNP-index)在染色体区域上的分布

    1. Li Z, Xu Y. Bulk segregation analysis in the NGS era: a review of its teenage years. Plant J. 2022;109(6):1355-1374. doi:10.1111/tpj.15646
    2. Takagi H, Abe A, Yoshida K, et al. QTL-seq: rapid mapping of quantitative trait loci in rice by whole genome resequencing of DNA from two bulked populations. Plant J. 2013;74(1):174-183. doi:10.1111/tpj.12105
    3. Abe A, Kosugi S, Yoshida K, et al. Genome sequencing reveals agronomically important loci in rice using MutMap. Nat Biotechnol. 2012;30(2):174-178. Published 2012 Jan 22. doi:10.1038/nbt.2095
    4. Fekih R, Takagi H, Tamiru M, et al. MutMap+: genetic mapping and mutant identification without crossing in rice. PLoS One. 2013;8(7):e68529. Published 2013 Jul 10. doi:10.1371/journal.pone.0068529
    5. Takagi H, Uemura A, Yaegashi H, et al. MutMap-Gap: whole-genome resequencing of mutant F2 progeny bulk combined with de novo assembly of gap regions identifies the rice blast resistance gene Pii. New Phytol. 2013;200(1):276-283.doi:10.1111/nph.12369
    6. Arikit S, Wanchana S, Khanthong S, et al. QTL-seq identifies cooked grain elongation QTLs near soluble starch synthase and starch branching enzymes in rice (Oryza sativa L.). Sci Rep. 2019;9(1):8328. Published 2019 Jun 6. doi:10.1038/s41598-019-44856-2

 图3.1泛基因组的构建

 图3.2泛基因组的组成