项目文章丨T2T基因组破译斑海豹皮肤与被毛演化的遗传密码

斑海豹（Phoca largha）是西北太平洋的冰生鳍足类，在我国主要分布于渤海和黄海。其繁殖依赖季节性海冰，对气候变暖导致的海冰消融和人为干扰高度敏感，是重要的生态保护指示物种。同时，作为中上层捕食者，它在近岸食物网和生态系统功能中扮演关键角色。

除生态价值外，斑海豹是研究生物适应寒冷与水环境的理想模型。其表皮系统（皮肤与被毛）对维持体温、屏障功能及环境抵御至关重要，解析其遗传基础对理解适应进化与物种保护具有重要意义。

然而，相关研究长期受限于高质量参考基因组的缺乏。现有染色体水平组装在连续性与端粒完整性上仍有不足，而其近缘物种港海豹（Phoca vitulina）的参考基因组仅为scafford水平。因此，构建一个结构完整、连续性高的染色体级基因组，是深入解析斑海豹适应性进化机制及开展有效保护研究的迫切需求。

表1 测序数据统计

在进行基因组组装前，基于短读长数据，利用GCE软件采用17-mer分析，估算斑海豹的基因组大小为2.43 Gb，杂合率为0.30%，重复序列占比为56.86%。通过HiFi、Hi-C、ONT数据，进行初步组装，染色体挂载及端粒延伸和补洞，最终获得2.39 Gb的gap-free基因组，contig N50为184.39 Mb，基因组序列锚定至16条染色体上，与前期已报道斑海豹二倍体核型（2n=32）细胞遗传学观察结果一致。

本研究通过多种互补指标对斑海豹基因组组装的整体质量和完整性进行评估（表2）。DNBSEQ 短读长、PacBio HiFi长读长和 ONT 超长读长的比对率分别达 99.99%、100.00% 和 99.95%，基因组覆盖度均超过 99.50%。Merqury k-mer 分析显示，基于 DNBSEQ 和 PacBio 数据的QV分别为53.77和55.82，证实组装序列的共识准确性极高。Hi-C 互作图谱显示，16 条染色体均存在强的染色体级互作信号。

研究检测了染色体末端的经典端粒重复序列（TTAGGG/CCCTAA）。结果显示，32 个染色体末端中有29个检测到端粒重复阵列（重复单元数 4~2907），而chr4的5'端、chr10的5'端和chr16的3'端未检测到经典端粒重复阵列（表 3）。

表2 斑海豹基因组信息统计及质量评估

表3 斑海豹基因组中染色体和端粒信息统计

图1 斑海豹基因组组装及注释信息

本研究结合同源比对和从头预测的方法注释重复元件：基因组中约含 955.49 Mb的重复序列，占组装总长度的39.91%（图1d）。其中，长散在核元件（LINE）含量最高（27.76%），其次为长末端重复序列（LTR，5.79%）和DNA 转座子（3.84%）。此外，基因组中鉴定出 1,611,509 个简单序列重复（SSR）位点，密度约为673个/Mb。整合从头预测、同源比对和转录组证据，进行蛋白编码基因预测：预测出20,037个蛋白编码基因，其中99.42%有功能注释。此外，本研究还鉴定出 42,205个ncRNA，包括821个miRNA、698个tRNA、416个rRNA和2,638个snRNA。

将本研究组装的斑海豹基因组与19个（10种鳍足类、8 种陆生食肉动物和 1 个外群）参考基因组进行比较分析，聚类分析鉴定出所有物种共有的13,256个直系同源基因群，从中筛选出 9,130个单拷贝直系同源基因用于系统发育分析，分析结果显示斑海豹与港海豹（P. vitulina）为姊妹群，分子钟估算二者分化时间约为 210万年。

研究分析了基因家族收缩和扩张，共鉴定出斑海豹 212个扩张的基因家族和486个收缩的基因家族，其中149个家族（612个基因）显著扩张，228个家族（247个基因）显著收缩（p<0.05）（图 2）。对显著扩张基因家族的GO富集分析显示，富集条目主要与表皮和细胞外基质过程相关。KEGG 富集分析进一步表明，这些扩张家族的基因在与上皮完整性和组织重构相关的通路中显著富集。上述富集结果表明，斑海豹的谱系特异性拷贝数变化涉及与上皮屏障功能和细胞外基质组织相关的基因集。

图2  20个物种间的系统发育关系与谱系特异性基因家族进化

此外，在斑海豹谱系上鉴定出 474 个正选择基因（PSG）。这些基因同样富集于表皮结构和功能相关的GO条目及KEGG通路，提示在序列水平上也存在与表皮适应相关的进化压力。

基于皮肤和被毛相关功能的反复富集，研究后续重点分析了两个在表皮结构和重构中具有明确作用的代表性基因家族——角蛋白（KRT）和基质金属蛋白酶（MMP），KRT家族基因在染色体上成簇分布（主要集中于chr13和chr15）（图3c），在食肉目中表现出保守的宏观共线性，但簇内的基因顺序在不同谱系间存在重组。MMP家族基因在染色体上分散分布（涉及多条染色体）（图3d），在物种间表现出高度保守的直系同源对应关系（图4）。这一对比揭示了与皮肤和毛发适应相关的基因家族在基因组组织和进化模式上存在显著差异。

图3 斑海豹中KRT和MMP基因家族的基因组组织与进化特征

图4 斑海豹与六个代表性物种间KRT（a-f）和MMP（g-l）基因家族的共线性比较