Nature项目文章丨鱼类演化生物学研究领域重大突破

脊椎动物演化中多次发生全基因组复制（WGD），复制后的基因组会从多倍体恢复为二倍体遗传方式，即再二倍化，这是真核生物复杂性演化的重要来源。但多数多倍化事件发生于数亿年前，基因组重塑复杂，再二倍化早期分子机制长期未被解析。

青藏高原特有鱼类裂腹鱼（裂腹鱼亚科，鲤科）是理想研究模型：该类群约 3000万年前发生同源多倍化，倍性覆盖4n-20n，兼具形态多样性与高海拔适应性，且基因组起源存在争议、缺乏单倍型解析的染色体水平基因组，制约了WGD 与再二倍化机制研究。

研究团队从中国新疆、甘肃和西藏自治区采集了裂腹鱼11个属代表性物种的野生标本（Schizothorax wangchiachii，Aspiorhynchus laticeps，Gymnodiptychus pachycheilus，Ptychobarbus dipogon，Schizopygopsis younghusbandi，Chuanchia labiosa，Platypharodon extremus和Herzensteinia microcephalus）。以拉萨裸裂尻鱼为核心材料构建亲-子代家系，采用PacBio HiFi、ONT 超长读长、Hi-C多技术联合测序，创新trio-binning单倍型组装策略完成单倍型基因组组装；同时解析弧唇裂腹鱼单倍型基因组，通过比较基因组学、细胞遗传学、群体重测序等方法开展研究。

（1）基因组测序证实多倍化

研究采用1.7 Tb的短读长数据对11个物种进行k-mer频率分布分析，多数物种在 1、2、4 倍测序深度有明显峰值，Platypharodon dipogon、Schizothorax wangchiachii分别在 20、6 倍深度出现峰值，证实前者为二十倍体、后者为六倍体。多数物种2倍 K-mer 峰值缺失，此结果证实了裂腹鱼同源四倍体普遍存在。

研究开发了基因组组装新方法对拉萨裸裂尻鱼进行基因组组装，最终组装结果含90条染色体，与核型结果一致。约55%基因序列为重复序列，注释到100,212个基因。

图1 裂腹鱼亚科鱼类均为同源多倍体

（a）基于线粒体基因组构建的11个裂腹鱼亚科系统发育树；（b）11个物种的k-mer频率分布；（c）拉萨裸裂尻鱼亲-子代家系图谱；（d）拉萨裸裂尻鱼核型；（e）拉萨裸裂尻鱼的Hi-C互作热图。

（2）单倍型间不平衡染色体融合

裂腹鱼单倍体染色体数本应为n = 25，但拉萨裸裂尻鱼组装及细胞遗传学观察染色体数为90条，非预期100条（4N=25×4），推测多倍化后可能发生染色体融合或丢失。通过与外群Onychostoma macrolepis基因组进行共线性分析，发现五对染色体融合，支持染色体减少是融合所致。但五次融合仅涉及四条同源染色体其中的两条，另外两条未融合。通过FISH实验验证了不平衡染色体的融合。

这一结构改变会引发关键遗传效应：融合染色体与未融合染色体之间形成重组抑制，并逐步建立偏好配对（preferential pairing）模式。研究团队借助单倍型间Ks值计算与系统发育拓扑结构分析，证实相关染色体完成了从四体遗传到二体遗传的转换；群体基因组分析显示，融合染色体上AAaa 基因型占比显著提高，基于48 个个体的重测序数据分析，印证偏好配对在自然群体中可稳定遗传。

图2  拉萨裸裂尻鱼基因组中的三次再二倍化事件

拉萨裸裂尻鱼四个单倍型的染色体水平共线性分析；（b）同源及部分同源染色体对的平均同义替换率（Ks）；（c–d）展示染色体对间平均 Ks 值的热图；（e）四条单倍型在全基因组范围内的系统发育拓扑结构分布；（f）基于重测序数据的二体基因型比值与等位基因频率分布。

（3）染色体融合位点是再二倍化的起始区域

在融合染色体上，二体基因型主要分布于融合位点附近，而染色体臂则多保持四体基因型。系统发育组学分析也印证了这一分布模式。以5 Mb滑动窗口估算融合与未融合染色体的分化水平，发现染色体中心区域分化程度最高，提示其更早开始分化；融合位点附近的蛋白序列分化也更显著。

理论上，融合位点的分化时间可代表再二倍化的起始时间。但该过程漫长且异步，说明WGD事件后曾存在一段时长未知的四体遗传过渡期。因此，基因组内首次发生再二倍化的时间（T2）可作为WGD时间（T1）的下限，其上限则由二倍体祖先分化时间（T0，约3000万年前）限定。基于分子钟估算，chr22与chr19融合事件对应的主峰分化时间约为3000万年前，第二轮再二倍化则始于1000–2000万年前。所有端粒区域均维持四体遗传，表明该区域同源重组仍在持续。

图3 再二倍化起始于染色体融合位点

（a）二体基因型与四体基因型的比例分布；（b）Ks 值在融合染色体上的分布（未融合区段 vs 融合区段）；（c）拉萨裸裂尻鱼的演化时间轴；（d）对 chr22 和 chr19 的分化时间估算。

（4）再二倍化过程中的染色体配对行为

为在细胞遗传层面深入解析裂腹鱼再二倍化的基因组重构过程，对拉萨裸裂尻鱼减数分裂中期Ⅰ染色体进行分析，发现同源多倍体典型的环状与链状构型。基于前期研究提出的“环状配对多由中着丝粒染色体形成，链状配对多由端着丝粒染色体形成”假设，注释其着丝粒序列，发现端着丝粒染色体主要用263bp重复单元（Cen263），其余染色体主要用254bp单元（Cen254）。通过着丝粒与端粒探针荧光原位杂交实验证实，环状构型为四价体配对，环状与链状二价体差异在于着丝粒位置，长链构型可能由融合染色体与1-2对未融合染色体配对形成。

图4 减数分裂中期 Ⅰ 的染色体行为

（a）精巢减数分裂中期 Ⅰ 细胞的核型图；（b）环状与链状结构形成示意图；（c）减数分裂中期 Ⅰ 染色体着丝粒与端粒的荧光原位杂交（FISH）图。

（5）同源基因的表达模式

在保留的四拷贝基因中，基于再二倍化的系统发育证据，选出2,449个二体遗传同源重复基因对（占一个单倍型上所有注释基因的9.8%）。在这些同源基因对的编码序列中，共鉴定出60,169个再二倍化位点，据此可确定来自uf 或f同源基因的转录本。利用11种组织（脑、鳃、肌肉、肝脏、肠道、肾脏、心脏、骨骼、皮肤、膀胱和脾脏）的 RNA-seq数据，比较uf与f同源基因对的相对表达水平：约 20%的同源基因对为uf偏向表达，仅10%表现为f偏向表达。

为探究同源基因表达分化是否在高海拔适应中发挥作用，对拉萨裸裂尻鱼幼鱼进行24小时低温（5°C）胁迫，并对5种组织进行RNA-seq测序。结果显示，鳃组织中的差异表达基因（DEGs）数量多于其他组织。尽管肝脏和心脏的差异表达基因中同源基因对富集，但其他三种组织未出现此富集现象。uf和f基因对低温胁迫的反应一致，即uf基因上调或下调时，其同源的f基因通常也会相应上调或下调。

图5  未融合拷贝（uf）中偏向性基因丢失与转录活性

（a）由等位基因丢失或旁系同源基因丢失导致基因缺失的示意图；（b）融合拷贝（f）的旁系同源基因丢失显著多于未融合拷贝（uf）；（c）基于11个组织的RNAseq数据，旁系同源基因更倾向于在未融合拷贝（uf）中高表达；（d）5种组织在对照组（恒温22℃）与冷处理组（低温5℃）间的差异表达基因数量。