项目文章丨双线巨篷蛞蝓染色体水平的组装注释

近日，浙江海洋大学水产学院韩志强教授团队在Scientific Data上以“Chromosomal-scale genome assembly and annotation of the land slug (Meghimatium bilineatum)”为题发表研究成果。本研究利用Illumina、PacBio和Hi-C的测序数据，组装了双线巨篷蛞蝓染色体水平基因组，通过从头基因预测、同源物种基因预测和基于转录组的基因预测进行了基因组注释，同时开展了双线巨篷蛞蝓和11个近缘物种的比较基因组分析，为该物种类群的进化历史和遗传机制研究提供了有价值的基因组信息。万摩科技承担了本研究的测序和分析相关工作。

（1）双线巨篷蛞蝓基因组大小评估

基于Illumina短读长序列(155 X)和GCE软件的k-mer分析方法，进行基因组信息评估。基因组评估大小为1.5 Gb，杂合度为1.05%，基因组重复度为43.69%。

图1 双线巨篷蛞蝓基因组大小评估和k-mer分布

（2）双线巨篷蛞蝓染色体水平基因组组装

利用HiFiasm软件组装HiFi测序序列(44 X)，初步组装基因组大小为1.8 Gb，通过Purge_Haplotigs软件进行基因组序列去冗余，得到1.63 Gb的Contig水平基因组，N50大小为1.37 Mb。随后利用Hi-C测序序列(88 X)和3D-DNA软件进行基因组染色体水平挂载，并通过JuiceBox软件进行调图，手工矫正组装错误，获得了25条染色体基因组，挂载率达到99.95%。最后得到1.61 Gb染色体水平基因组，scaffold N50大小为68.08 Mb。

图2 双线巨篷蛞蝓基因组染色体水平Hi-C热图

（3）双线巨篷蛞蝓基因组重复序列鉴定和分类

通过从头预测和同源预测方法，鉴定了基因组串联重复序列和散在重复序列。基于同源比较方法，利用RepeatMasker和RepeatProteinMask软件鉴定散在重复序列；基于从头预测方法，利用TRF软件鉴定基因组串联重复序列。最后整合两种方法的预测结果，共得到1.18 Gb的重复序列，基因组占比达到72.51%，其中主要重复序列为占比34.08%的长散在重复元件(LINE)。

表1 双线巨篷蛞蝓基因组转座元件统计

（4）双线巨篷蛞蝓基因组编码基因鉴定和注释

通过AUGUSTUS、Genscan和GlimmerHMM三款软件执行重复掩蔽后基因组从头基因预测，鉴定蛋白编码基因；随后通过同源预测方法，利用TBLASTN软件比对基因组至7个近缘物种蛋白序列检测基因候选区域，再通过GenWise软件将筛选的蛋白序列比对至基因组以鉴定剪切位点；然后基于转录组预测方法，通过TopHat和Cufflinks软件组装转录本，利用PASA软件鉴定蛋白编码基因；最后利用MAKER2和HiFAP软件整合以上三种方法预测结果，得到完整和非冗余的参考基因数据库。最终在基因组中鉴定到18,631个蛋白编码基因。

表2 双线巨篷蛞蝓基因组基因预测统计

图3 8个物种预测编码基因比较

利用BLAST软件将预测的基因序列比对到InterPro，GO，KEGG，SwissProt，TrEMBL，TF，Pfam，NR和KOG功能预测数据库来注释编码基因的功能，同时预测了与功能注释相关的保守蛋白结构域和基序，最后成功注释了15,569个功能基因。

表3 双线巨篷蛞蝓基因组编码蛋白基因功能预测

（5）双线巨篷蛞蝓比较基因组分析

通过OrthoMCL软件鉴定双线巨篷蛞蝓和其他11种软体物种的单拷贝直系同源基因，并基于135个单拷贝基因，利用RAxML软件构建了12个物种间的系统发育关系。通过PAML软件中的MCMCtree程序包评估12种软体物种的分歧时间，显示双线巨篷蛞蝓和C. unifasciata亲缘关系较近，分歧时间大约为231.4 MYA。最后通过CAFE软件鉴定了12个物种扩张收缩基因家族，结果表明双线巨篷蛞蝓有879个扩张基因家族和1,385个收缩基因家族。

图5 12个物种系统发育分析