项目文章丨水稻超大粒形成的分子基础解析

1. ULG超大粒基因组组装

该研究从5000多份种质中鉴定到一个千粒重超过60 g的超大粒种质资源ultra-large grain (ULG)，与高产优质水稻品种SN265相比较，ULG的籽粒长度、宽度、株高与穗长等都显著增加。为了研究ULG优良性状的基因调控机制，该研究对ULG种质进了行基因组组装。利用18.70GB的HiFi数据、42.0GB的Hi-C数据进行基因组的构建与挂载，并基于40.1GB的二代数据进行纠错，最终获得了染色体级别的高质量基因组，contig N50达到了15.91MB，注释得到了37,280个基因，基因组完整度达到了98.3%。

2. ULG基因组与其他水稻基因组的比较分析

将超长粒ULG基因组与籼稻参考基因组R498、粳稻参考基因组Nipponbare、高产优质水稻品种SN265进行了基因组间的变异鉴定，其中，ULG与粳稻Nipponbare的差异是最小的。同时进行了四个基因组的基因家族聚类与进化树分析，结果表明ULG与Nipponbare共有的基因家族最多，且这两个基因组在进化树上更近，以上结果都表明，ULG与粳稻的进化关系更近。

3. 超大粒性状的定位分析

为了分离ULG相关位点，本研究首先将ULG与SN265杂交，获得F2群体，选择其中30个超大籽粒子代与小圆粒子代分别进行混池测序。利用亲本与子代混池测序数据进行BSA分析，最终在3号染色体上确定了一个跨越12.19MB的候选区域。

同时，该研究利用ULG和SN265杂交的F8代RIL群体，203个RIL子代进行QTL分析，基于LOD阈值为2.5的ICIM方法，在三号染色体上确定了3个QTL，LOD值为2.65-23.45，PVE（表型方差解释）为0.02-28.75。

BSA与QTL两种定位方法都表明候选基因位于3号染色体上，其中qULG-1 （LOD评分=2.65）与已报道的两个籽粒大小调节基因OsLG3、OsMADS1定位在同一区域，qULG-3（LOD评分=23.45）与已报道两个籽粒大小调节基因GL3.1、GS3定位在同一区域。同时，比较ULG与SN265两个基因组序列后发现，与SN265相比，ULG在所有4个基因区域上都具有优势的单体型，因此本研究推断ULG至少包含4个已知的籽粒长度调节基因。

4. OsLG3、OsMADS1、GS3和GL3.1四个基因对籽粒大小调节的影响

为了研究OsLG3、OsMADS1、GS3和GL3.1对籽粒长度的影响，该研究首先在ULG遗传背景下使用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建了这些基因的敲除系。

在ULG与SN265遗传背景下，敲除OsLG3和GL3.1均减少了籽粒长度。在SN265遗传背景下，敲除GS3增加了籽粒长度，而敲除GS3不能进一步增加ULG的籽粒长度。同时观察到，ULG和SN265遗传背景下，OsMADS1基因敲除后均会导致花器官异常。

为了确认OsLG3、OsMADS1、GS3和GL3.1在调节籽粒大小方面的作用，本研究评估了4个基因在203个RILs中的作用。其中携带OsLG3和OsMADS1的ULG等位基因的植株粒长略大于携带SN265等位基因的植株，但差异不显著。与GS3^SN265相比，GS3^ULG等位基因显著增加了籽粒长度。同样，携带GL3.1^ULG等位基因的植株比携带GL3.1^SN265等位基因的植株表现出更大的籽粒长度，其中GL3.1^ULG基因对籽粒伸长的影响最大，对应了QTL分析中GL3.1所在qULG-3区域的LOD值最高这一结果。

5. 四个基因在籽粒长度调节方面存在加性效应

为了研究在SN265遗传背景下ULG等位基因是否能增加籽粒长度，该研究以 ULG 为供体亲本，以 SN265 为受体亲本，培育了一系列近等基因系NILs。经过4代回交与4代标记辅助选择的近交，获得了含有单、双、三、四倍ULG等位基因的NIL子代，通过比较这些NIL的籽粒长度，发现OsLG3、OsMADS1、GS3和GL3.1之间存在加性效应，且OsLG3^ULG、OsMADS1^ULG、GS3^ULG和GL3.1^ULG的组合对应了NIL中最大的籽粒长度。同时，与前文研究结果一致，GL3.1在籽粒调节中起着关键作用。

为了阐明四个基因间相互作用的分子机制，进行了酵母双杂交实验，结果显示OsLG3、OsMADS1、GS3和GL3.1之间没有相互作用，只有OsMADS1和GS3之间存在相互作用。

在ULG背景下，将四个基因敲除突变体的差异表达基因(DEGs)进行比较，发现共有1491个基因。同时，将含有ULG型等位基因的NILs与SN265基因的DEGs进行比较，发现了579个共表达基因。PFAM富集和GO分析表明，112个基因在孢粉素生物合成和花粉外壁形成相关的生物过程中富集，其分子功能与羧化酶和碳-碳裂解酶活性相关。值得注意的是，与ULG相比，CRISPR/Cas9敲除系中几乎所有112个基因都下调，而112个基因中的大多数基因在NILs中上调。 

6. 籽粒调节相关新基因座的发现

ULG的籽粒长度超过了含有四倍ULG等位基因的NIL子代，这表明除了以上4个基因外，还有其他基因对ULG籽粒长度有影响。将ULG与SN265候选区域的序列进行了比较，在910个预测基因的候选区域中，发现59个基因存在非同义snp, 14个基因在SN265和ULG之间存在移码突变。在qULG2区域中只出现了一个位点(LOC_Os03g28270)，编码一种富含亮氨酸的重复受体样激酶(LRR-RLK)，被命名为qULG2-b。

为了证实qULG2-b参与籽粒长度的调控，该研究创建了CRISPR/Cas9敲除纯合突变体。结果表明，qULG2-b敲除纯和突变体的籽粒明显长于WT，表明qULG2-b对籽粒长度起负调节作用。

7. 利用OsLG3、OsMADS1和GS3的多效性提高SN265的耐力性状与籽粒质量

最新研究表明，除了籽粒长度调节以外，OsLG3、OsMADS1和GS3还具有多效性，因此本研究旨在基于这三个基因来提高SN265的性状。对前文构建的NIL群体进行了耐旱性、耐热性、耐碱性、垩白率、粒宽和每穗粒数。

NIL群体中，携带OsLG3^ULG的NILs表现出更高的耐旱性，GS3^ULG在不影响耐碱性的情况下提高了耐热性，OsMADS1^ULG提高了垩白相关性状，GL3.1^ULG显著影响了垩白率和每穗粒数。这些转基因植物在干旱、高温和碱性胁迫下的存活率显著提高。