项目文章丨二倍体和四倍体泥鳅单倍型基因组组装以及鱼类气呼吸相关基因Mex3a的鉴定

文章原名：Chromosome-scale and haplotyperesolved genome assembly of the autotetraploid Misgurnus anguillicaudatus

文章译名：同源四倍体泥鳅的染色体级别单倍型基因组组装

发表时间：2024年9月28日

发表期刊：Scientific Data

IF：5.8

文章链接：https://doi.org/10.1038/s41597-024-03891-z

多倍体进化是遗传多样性的重要来源，促进基因组重组和新性状进化。植物中多倍体已被广泛研究，例如甘蔗、马铃薯和紫花苜蓿等。相比之下，脊椎动物中多倍体现象相对稀少，因此对其研究相对有限。泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）是一种小型淡水鱼类，在中国、日本、韩国和其他东南亚国家广泛分布。研究表明，泥鳅群体中存在自然发生的二倍体、三倍体、四倍体、五倍体和六倍体等多种倍性形式。其中，四倍体泥鳅（4n = 100 ）与二倍体泥鳅（2n = 50）共存于同一环境中，被认为是由染色体加倍形成的同源四倍体。泥鳅这种独特的倍性多样性使其成为研究脊椎动物多倍体进化的理想模型生物。然而，目前泥鳅的基因组数据不足。

1、同源四倍体泥鳅基因组的染色体水平基因组组装与注释

研究者首先对同源四倍体泥鳅（雌性）进行核型分析，并将 100 条染色体根据着丝粒的位置分为三种类型（中着丝粒染色体 （MC）、亚中着丝粒染色体 （SC） 和近着丝粒染色体 （AC））。

通过Illumina测序（242.72 Gb （~51×））采用 K-mer 方法评估泥鳅基因组大小和杂合率分别为2,315 Mb 和 1.38%。随后利用PacBio HiFi测序数据（92.9 Gb （~20×））和Hi-C （423.61 Gb （~89×） ）用HiFiasm进行初步组装，获得一个基因组大小4,761 Mb 、contig N50 为 6.78 Mb的contig级别的基因组。组装的基因组使用 BWA 软件和minimap2软件分别用Illumina 短读长和Pacbio 长读长评估组装的完整性，reads的比对率和覆盖度均在99.8%以上。使用BUSCO和 actinopterygii_odb10 数据库评估基因组组装的完整性，分析结果显示，96.81% 的基因被鉴定为完整基因，包括3.85%的单拷贝基因和92.97%的重复基因。用Hi-C辅助挂载构建出4.76 Gb的同源四倍体泥鳅基因组，染色体条数100 条，挂载率95.43%，contig N50 为 6.78 Mb，scaffold N50 为 44.11 Mb。

使用从头和基于同源的方法来预测基因组的重复元件，鉴定了约 2.9 Gb （61.03%） 的重复序列。基因预测基于从头预测、同源的注释和转录组的注释方法，最后MAKER软件整合，预测了92500个蛋白质编码基因。

同源四倍体泥鳅（雌性）基因组组装的Hi-C互作热图和圈图

2、单倍型组装和表达分析

本研究使用 JCVI 软件进行共线性分析，所有单倍型基因组均表现出高度共线性，这表明研究者成功地进行了染色体水平单倍型基因组组装。并使用 MUMmer、Nucmer 和 SyRI 软件进行全基因组比对和结构变异检测。本研究通过识别等位染色体之间的共线性基因对，并分析等位基因的表达水平，发现四个单倍型基因组之间没有显著的优势单倍型。

H1-H4四个单倍型基因组共线性分析和等位基因表达分析

研究者完成首个同源四倍体泥鳅的染色体水平单倍型基因组组装，为解析多倍体形成的遗传机制提供了重要数据支持。

文章原名：The loach haplotype-resolved genome and the identification of Mex3a involved in fish air breathing

文章译名：泥鳅单倍型基因组组装和鱼类气呼吸相关基因Mex3a的鉴定

发表时间：2024年10月10日

发表期刊：Cell Genomics

IF：11.1

文章链接：https://doi.org/10.1016/j.xgen.2024.100670

鱼类作为最早的脊椎动物，经历了复杂的进化过程，最终演化出人类。空气呼吸能力的出现是鱼类进化史上的一个关键适应，使其能够从水生环境过渡到陆生环境，摆脱了水的限制。目前已报道约有 400 种鱼类具有空气呼吸能力，血管生成与空气呼吸能力密切相关。迄今为止，基于具有空气呼吸能力的单一鱼类的基因组分析、多个非硬骨鱼类的比较基因组学分析以及鱼类空气呼吸器官的转录组学研究，一些与血管生成相关的基因已被筛选出来。然而，这些基因还未被确认为鱼类空气呼吸基因。泥鳅的 CRISPR-Cas9 编辑技术成熟，且繁殖能力强，因此适合作为揭示鱼类空气呼吸分子机制的模型生物。利用这一模型，我们能够有效揭示鱼类空气呼吸形成的复杂机制，从而深入了解鱼类向陆地转变的进化历程。

1、筛选与血管生成相关的基因

针对与鱼类空气呼吸相关的基因，研究者对之前研究中获得的120个正选择基因（PSGs）进行了GO和KEGG功能富集分析。发现四个基因与血管生成相关：mex3a: 血管形态发生 (GO: 0048514)，hspb1: 血管内皮生长因子 (VEGF) 信号通路 (ko04370)，bmp4: 转化生长因子 β (TGF-β) 信号通路 (ko04350)，angptl4: 血管生成相关通路 (GO: 0001525)。因此，这四个与血管生成相关的基因的正选择可能有助于泥鳅的肠道空气呼吸。

2、泥鳅单倍型基因组组装及注释

研究者在前期泥鳅染色体水平基因组的基础上，结合Pacbio HiFi和Hi-C数据拆分并组装了二倍体泥鳅两套单倍型基因组Mchra和Mchrb。其中Mchra基因组大小约为 1.09 Gb，Scaffold N50约43.61 Mb；Mchrb基因组大小约为1.11 Gb，Scaffold N50约43.99 Mb。通过 BUSCO评估表明Mchra和Mchrb基因组完整性分别达到97%和96.8%，进一步提高了泥鳅基因组的完整性和准确度。Mchra和Mchrb单倍型基因组中的重复序列分别约占59.87%和59.54%，Mchra和Mchrb单倍型到基因组分别注释了24,400个和24,544个蛋白编码基因。圈图和基因组共线性揭示了两种泥鳅单倍型基因组特征的相似性。

Mchra 和 Mchrb 单倍型基因组的基因组特征圈图

3、mex3a、hspb1、bmp4和angptl4的进化分析

为了研究参与泥鳅肠道空气呼吸的基因，我们对古空气呼吸鱼类（如眼斑雀鳝和非洲肺鱼）及非空气呼吸的硬骨鱼（如斑马鱼）的基因组进行了进化分析，重点关注mex3a、bmp4、hspb1和angptl4基因。在泥鳅的四个正选择基因中，只有mex3a基因从非洲肺鱼和眼斑雀鳝中继承下来，这表明mex3a基因较为古老，可能在鱼类空气呼吸中发挥了作用。

mex3a、bmp4、hspb1 和 angptl4 的基因进化分析

4、mex3a的功能分析

研究者选取了三种常见的空气呼吸鱼类（泥鳅，乌鳢和黄鳝），通过实验发现，当这些鱼类暴露在空气中时，其 Mex3a 基因的表达水平显著上调，这表明 Mex3a 基因可能与鱼类的空气呼吸能力相关。对泥鳅的 Mex3a 基因进行了组织表达和定位分析，发现其在后肠中的表达水平最高，并且主要表达在粘膜层的血管中。研究结果表明，古老的正选择基因mex3a与血管生成有关，参与了泥鳅肠道空气呼吸的过程。

通过CRISPR-Cas9系统，研究者在泥鳅中构建了mex3a基因敲除（KO）模型。空气暴露实验结果显示，KO泥鳅的存活时间显著低于WT泥鳅。后肠的组织学分析、透射电子显微镜（TEM）和MCAM 标记血管发现，KO泥鳅血管数量和黏膜层中的红细胞（RBCs）数量显著少于WT泥鳅。在慢性缺氧条件下，KO泥鳅的空气呼吸频率显著低于WT泥鳅，而其水中的耗氧量则显著高于WT泥鳅。此外，KO泥鳅中与血管生成相关的基因（如vegf、epo、hbb和eno3）的表达显著下调。这些结果再次强调了mex3a基因在泥鳅后肠血管生成中的重要作用，其缺失导致了泥鳅空气呼吸能力的下降。

WT泥鳅和KO泥鳅的生存时间、后肠结构变化和耗氧量分析

为了探索mex3a对血管发育的调控机制，研究者对空气暴露下泥鳅后肠进行了转录组测序。转录组分析显示，KO泥鳅与WT泥鳅相比，共有920个差异表达基因（DEGs），其中390个基因上调，530个基因下调。 与血管生成相关的基因在KO泥鳅中表达显著下调。qPCR 分析验证了转录组数据的可靠性。研究者进行了免疫共沉淀（IP）分析和免疫荧光染色，揭示了Mex3a通过与Tbx20的相互作用，参与了Tbx20-Prok2-Prokr1信号通路，从而调控鱼类的血管生成。

为了验证在泥鳅中的发现，研究者利用 CRISPR-Cas9 技术构建了斑马鱼中 Mex3a 基因的敲除模型。Mex3a 基因敲除导致斑马鱼腹部血管生长受到抑制，显著抑制了Tbx20、Prok2和Prokr1基因的表达，这些发现进一步证实了古老基因mex3a在血管生成过程中所发挥的重要作用。

mex3a 的组织表达分析及斑马鱼早期发育血管的观察

Mex3a 过表达和敲低对HUVECs迁移和成管能力的影响

5、泥鳅Mex3a突变N201S对人脐静脉内皮细胞迁移和管形成能力的影响

对不同物种中的 Mex3a 蛋白氨基酸序列进行了比较，发现 Mex3a 蛋白在不同物种中具有高度的保守性。然而，泥鳅中的 Mex3a 蛋白在第 201 位的氨基酸发生了突变，从天冬酰胺（N）变成了丝氨酸（S），而斑马鱼和西藏高原鳅中的 Mex3a 蛋白在第 201 位的氨基酸是丝氨酸。蛋白质结构预测显示，泥鳅中 Mex3a 蛋白的RING-finger结构域的空间构象与斑马鱼和西藏高原鳅中的 Mex3a 蛋白不同。这表明泥鳅中 Mex3a 蛋白第 201 位的氨基酸突变可能影响其空间结构，进而影响其功能。

通过细胞迁移实验发现，与对照组（egfp）相比，泥鳅（mex3a-Ma组）和斑马鱼（mex3a-Dr组）的Mex3a均能在常氧条件下促进人脐静脉内皮细胞的迁移和管形成，但是泥鳅（mex3a-Ma组）在缺氧条件下的促进作用比斑马鱼更为显著。此外，研究者在人脐静脉内皮细胞中建立了泥鳅Mex3a突变模型（N201S），该模型显示出与斑马鱼Mex3a类似的趋势，能够促进人脐静脉内皮细胞的迁移和管形成。

人脐静脉内皮细胞的迁移和血管形成能力

研究者进行泥鳅的单倍型基因组组装，结合正选择分析和基因演化分析鉴定到一个古老的鱼类气呼吸基因Mex3a。通过构建泥鳅、斑马鱼（fli1a:EGFP）Mex3a敲除模型和Mex3a过表达、敲降、点突变的人脐静脉内皮细胞模型并结合转录组等方面揭示了 Mex3a 参与血管生成的分子机制。该研究创新性地鉴定出鱼类气呼吸基因Mex3a，为培育耐低氧鱼类品种以及解决水产养殖中的缺氧问题提供可靠的分子靶点。