项目文章丨基于转分化方式改造成纤维细胞为主动脉瓣细胞

2024年11月，华中科技大学生命学院陈俊威教授及韦富香副教授团队、协和医院董念国教授团队、美国东北大学汪宁教授团队在Bioactive Materials杂志在线发表了题为“Engineering aortic valves via transdifferentiating fibroblasts into valvular endothelial cells without using viruses or iPS cells”的研究论文，其中万摩科技提供的测序和分析服务，帮助鉴定了诱导分化的细胞与原代瓣膜细胞、静脉血管内皮细胞、皮肤成纤维细胞之间的亲缘关系。

1、基质刚度对小鼠成纤维细胞向iAECs转分化效率的影响

为了研究基质刚度对成纤维细胞向iAECs（诱导性主动脉内皮样细胞）转分化效率的影响，研究人员采用了不同刚度的聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为基质，以模拟各种细胞外基质的刚度。研究结果显示，中等刚度的PDMS 10（大约2.1 Mpa）显著提升了成纤维细胞向iAECs的转分化效率，该效率高达70%。在最佳刚度条件下转分化的iAECs在功能和表型上与血管内皮细胞相似，进一步证实了基质刚度在调控转分化过程中的重要作用。

图1 基质刚度调节小鼠成纤维细胞向iAECs转分化效率

2、评估iAECs在体内血管修复与再生中的应用潜力

为了确认iAECs是否具备与MAECs（小鼠原代动脉内皮细胞）相似的功能，从而评估iAECs在体内血管修复和再生方面的应用潜力，研究人员在特定的基质刚度条件下将小鼠成纤维细胞转分化为iAECs，并将其与MAECs进行了对比。研究结果表明，在体外血管形成实验中，iAECs展现出了与MAECs相仿的血管生成能力，其增殖能力也与MAECs相当，这表明它们在生命周期特征上具有相似性。这些结果共同揭示了iAECs在功能上与MAECs的相似性，为iAECs在血管疾病治疗和再生医学领域的应用提供了实验支持。

图2 iAECs表现出与MAECs相似的功能

3、人类成纤维细胞转分化为hiVECs

为了实现人类成纤维细胞向hiVECs（诱导性血管内皮细胞）的转分化，研究人员在特定的培养基中培养这些细胞，并通过引入特定的转录因子或应用小分子化合物来诱导转分化过程。该研究成功地将人类成纤维细胞转化为hiVECs，这些转化后的细胞展现了血管内皮细胞的典型特征。转化得到的hiVECs表达了血管内皮细胞的特异性标志物，包括VE-cadherin和vWF等，并在体外实验中展示了与原生血管内皮细胞相仿的血管形成和血管通透性功能。

图4 成纤维细胞向hiVECs的转分化

同时，作者利用万摩科技提供的RNA-seq数据和分析结果，在基因表达层面证实了由成纤维细胞转化而来的hiVECs与瓣膜内皮细胞HAVECs具有高度的相似性，从而支持了其作为VECs替代细胞的潜力。

这些成果证实了人类成纤维细胞向hiVECs转分化是可行的，并确认了hiVECs在功能上与HAVECs（原代人主动脉瓣膜内皮细胞）的相似性，为hiVECs在再生医学、药物研发以及疾病模型构建等领域的应用奠定了科学基础。

4、iAECs 与 hiVECs 能在脱细胞瓣膜上保持功能

为了评估iAECs和hiVECs在去细胞化心脏瓣膜上承受流体剪切应力后是否能维持其功能性，研究人员对心脏瓣膜进行了去细胞化处理。此外，研究人员对植入了细胞的瓣膜施加了流体剪切应力，以模拟体内血流动力学条件。

研究结果显示，在流体剪切应力的作用下，iAECs和hiVECs在去细胞化瓣膜上成功保持了血管内皮细胞的功能，包括形成血管网络和维持血管通透性。同时，细胞在瓣膜表面表现出良好的粘附性，即便在流体剪切应力的影响下也没有出现显著的脱落现象。进一步地，经过流体剪切应力处理后，细胞仍然表达出血管内皮细胞特有的分子标志物，例如VE-cadherin和vWF。这些结果表明，iAECs和hiVECs在去细胞化瓣膜上经受流体剪切应力后，能够保持其功能性，这为将这些细胞应用于组织工程心脏瓣膜的构建提供了有力的实验支持。

图6 iAECs与hiVECs在经过流体剪切应力作用后，仍能保持在脱细胞瓣膜上并保持功能

5、基于iAECs 与 hiVECs构建的工程心脏瓣膜的体内评估

为了评估基于iAECs和hiVECs构建的工程化主动脉瓣在体内的功能性和生物相容性，研究人员进行了实验，以确定这些细胞是否能够促进瓣膜在体内的整合和长期稳定性。作者将iAECs和hiVECs种植到去细胞化或人工支架上，构建了工程化主动脉瓣，并进行了同种异体或异种移植。

实验结果显示，植入的工程化主动脉瓣在体内展现了良好的开合功能，血流动力学参数表明其功能与正常瓣膜相似。组织学分析揭示，iAECs和hiVECs在瓣膜中存活，并与支架材料实现了良好的整合，从而促进了瓣膜组织的再生。此外，植入的瓣膜表现出较低的炎症反应和血栓形成风险，并未观察到明显的免疫排斥现象。

图7 iAECs和hiVECs在组织工程主动脉瓣上在体内功能良好

6、iAECs和hiVECs在工程主动脉瓣上的成熟与功能性评估

为了探究工程主动脉瓣上的iAECs和hiVECs是否能获得与原生主动脉内皮细胞AECs或血管内皮细胞VECs类似的分子特征，研究人员将iAECs和hiVECs种植于工程主动脉瓣的支架上，并在特定的培养条件下进行培养。

研究结果表明，iAECs和hiVECs在工程化主动脉瓣上表达了AECs或VECs的特异性分子标志物，包括VE-cadherin、vWF和eNOS。通过基因表达谱分析，发现工程化瓣膜上的细胞与原生AECs或VECs在多个基因表达上表现出高度相似性。功能测试进一步显示，这些细胞在体外模型中展现了与原生AECs或VECs相似的功能，例如能够形成血管样结构并响应流体剪切应力。这些发现证实了iAECs和hiVECs在工程化主动脉瓣上能够获得与原生AECs或VECs相似的分子特征和功能，为这些细胞在再生医学领域的应用提供了进一步的支持证据。

图8 iAECs和hiVECs在体内保持了1个月类似于AECs或原生VEC的特征

7、经转分化过程产生的 hiVEC 相较于 iPSC 展现出更高的安全性

为了评估通过转分化技术生成的hiVECs与利用iPSCs（诱导性多能干细胞）分化技术生成的hiVECs在安全性上的差异，研究人员分别采用了这两种方法来制备hiVECs。

研究结果显示，采用转分化技术获得的hiVECs在动物模型中未表现出致瘤性，而源自iPSCs的hiVECs则存在潜在的致瘤风险。此外，转分化生成的hiVECs表现出较低的免疫原性，而iPSCs衍生的hiVECs可能由于残留的多能性特征，引发更强烈的免疫反应。在基因组稳定性方面，转分化产生的hiVECs显示出更高的稳定性，而iPSCs来源的hiVECs可能面临基因组变异的风险。尽管如此，在体外模型中，两种hiVECs均表现出相似的功能性，这表明安全性上的差异并不影响它们作为治疗手段的潜在效果。综上所述，转分化技术生成的hiVECs在安全性方面优于iPSCs分化技术生成的hiVECs，这为转分化hiVECs在临床应用中的使用提供了更为坚实的支持。