PBJ项目文章丨柚T2T基因组的构建及柚果实果基长度遗传机制研究

图1 柚种质资源的果基长度差异

（1）代表性短果基柚的T2T基因组组装

为解析柑橘果基长度的遗传基础，研究团队对代表性短果基品种“坪山柚”和长果基品种“沙田柚”进行基因组组装。对于“坪山柚”基因组组装，整合25.70 Gb PacBio HiFi 长读长数据（N50 =16.81 kb，69.25×）、19.57 Gb Nanopore 超长效据（N50 = 100 kb，52.72×）及96.39× Hi-C数据，通过 Hifiasm、NextDenovo等工具完成组装，最终获得371.17 Mb 的无间隙T2T基因组，contig N50达32.72 Mb，BUSCO完整性达98.30%，仅5号和6号染色体的部分端粒未被完整组装。“沙田柚”基因组（379.26 Mb）含5个间隙，两品种间存在15,015个PAV变异和273万个SNP，在3、4、8号染色体上差异尤为明显。该研究构建了目前最完整的柚类参考基因组，为后续遗传分析提供了高精度参考基因组。

图2“坪山柚”T2T基因组组装

（2）果基长度的遗传定位

利用“琯溪蜜柚”（长果基）ד坪山柚”（短果基）构建的192株杂交群体，通过BSA分析将控制果基长度的区间定位至1号染色体27.5–30.5 Mb区域（含258个基因）。进一步结合亲本及极端子代单株的全基因组重测序分析，鉴定到一个与果基长度显著关联的52 bp变异：该52 bp变异在“琯溪蜜柚”中为杂合缺失状态，而在“坪山柚”中无缺失；在杂交群体中，该变异可作为高效分子标记用于短果基单株筛选。77.31%的长果把子代该52 bp基因型为杂合缺失，76,84%的短果把子代该52 bp表现为无缺失。

图3 果基长度相关变异的遗传定位和鉴定

（3）CgABR1和CgFAD负调控果基长度

通过比较“琯溪蜜柚”与“坪山柚”的果基发育关键期RNA-seq数据，在BSA区间内鉴定到CgABR1和CgFAD为候选基因，两者在短果基品种中高表达。番茄转基因实验表明，过表达CgABR1和CgFAD分别导致果基长度缩短50.43%和48.39%，证实两者负调控果基长度。结合GO富集分析，推测其通过影响微管骨架动态或氧化还原过程调控细胞伸长。

图4 CgABR1和CgFAD的过表达缩短了果基长度

图5 CgABR1直接靶向CgFAD负调控果基长度

（4）CgABR1靶向并激活CgFAD

通过DAP-seq技术鉴定到CgABR1的4,897个结合峰，其中77.28%位于基因启动子区，且在CgFAD启动子上游400 bp处显著富集。双荧光素酶报告实验（LUC）证实CgABR1可激活CgFAD启动子活性，而EMSA实验显示CgABR1 通过识别启动子区GGCGG元件直接结合CgFAD。进一步分析表明，CgABR1与CgFAD形成调控模块：CgABR1通过激活CgFAD表达，抑制果基长度。自然群体中CgABR1基因及其启动子未检测到与果基长度相关的序列变异，提示其功能可能主要是通过转录调控而非序列突变实现。

本研究成功组装了坪山柚的T2T无间隙参考基因组，鉴定出调控果基长度的关键基因CgABR1和CgFAD，并揭示了二者的调控关系，即CgABR1通过结合并激活CgFAD的表达来负调控果基长度。研究还发现与果基长度紧密连锁的52bp缺失，可作为预测和鉴定果基长度的分子标记，为柑橘的遗传改良和育种提供了重要的遗传资源和理论依据。